Étape 17 : Advanced DIYBio analyse génétique : l’alignement et l’analyse de séquences
Si vous avez votre produit PCR et maintenant vous voulez voir ce qu’il dit ?
Comme un DIYbiologist, il peut être difficile de trouver un noyau installation de séquençage d’ADN, mais il vaut la peine de fouiller votre université locale ou de la recherche sur internet pour « services de séquençage de l’ADN ». Il peut être difficile de trouver un endroit qui est disposé à prendre l’ADN de personnes indépendantes, surtout celles qui purifier par des méthodes de « homebrew », donc c’est où le partenariat avec un laboratoire de DIYBio local est probablement le meilleur. Dans les deux cas, vous devrez envoyer la facilité de séquençage votre ADN avec des amorces (ou séquences d’amorces) vouloir leur séquence avec, vous pouvez utiliser vos amorces PCR ou concevoir des amorces "imbriquées" supplémentaires au sein de votre PCR amplicon à séquence avec (recommandé).
Une fois que vous êtes en mesure de trouver une installation de séquençage et vous recevez vos résultats de séquençage, que vous aurez besoin de les analyser. Je dois encore trouver le parfait alignement de séquences libre et un logiciel de montage. Pour la plupart vous pouvez éditer ou aligner les résultats du séquençage (chromatogrammes), pas les deux, et c’est une vraie douleur pour modifier chaque chromatogramme séparément puis aligner le basecalls (format texte). C’est où les produits commerciaux ont la haute main définitive.
Les images ci-dessus sont des chromatogrammes HBB que j’ai généré et la séquence de référence HBB dans BioEdit, qui permet les mêmes fonctions que les produits commerciaux cependant il ne permet que de l’alignement par paires. De UNIPRO UGENE semble également bon, mais je n’ai pas utilisé. Alternativement, vous pouvez éditer et convertir tous les chromatogrammes en fichiers texte et alignez-les en utilisant un logiciel comme Clustal ou n’importe quel nombre des programmes dans cette liste.
Une fois que vous chargez vos chromatogrammes que vous voudrez modifier les séquences pour s’assurer que le programme automatisé fait les appels bâtis droit en cliquant dessus à la séquence modifiable (seconde photo). Une fois que vous avez toutes les séquences édités, vous pouvez les aligner à leur séquence gratuit et résoudre toute divergence ou vérifier nucléotides hétérozygotes. Vous pouvez également préparer la séquence de référence en affichant des caractéristiques (photo de troisième et quatrième) afin que vous pouvez voir les polymorphismes (variations, cinquième photo) dans l’ordre et, après avoir aligné, voir si votre échantillon a des polymorphismes.
Pour télécharger la séquence de référence (que ce soit pour concevoir des amorces contre elle pour les étapes précédentes ou pour aligner dans cette étape) trouver le gène que vous cherchez dans la base de données de gènes à NCBI. Lorsque vous cliquez sur dans le gène enregistrer faites défiler jusqu'à la section "Séquences de référence NCBI (RefSeq)" et cliquez sur le lien 'GenBank' sous la RefSeqGene "Genomic". Cela vous mènera à la GenBank (sixième photo) de la séquence où vous pouvez télécharger la séquence de référence en cliquant sur le menu déroulant à côté de 'Envoyer' (photo septième).