Étape 16 : Advanced DIYBio analyse génétique : PCR et l’analyse de Gel
La méthode de la réaction en chaîne par polymérase (PCR) est l’un des outils plus puissants dans la boîte à outils le généticien. PCR est une méthode enzymatique logarithmiquement amplifier les régions ciblées d’ADN pour une analyse plus approfondie à l’aide d’une série de chauffage et de refroidissement des étapes. Est bien loin le temps des stagiaires plongeant de flacons d’échantillons dans des bains d’eau, aujourd'hui nous utilisons thermocycleurs automatisés avec un élément Peltier pour cycle de températures et quelques citoyens-chercheurs ont même conçus versions DIY pour nous bricolage-biologistes à utiliser.
Le thermocycleur DIY plus simple que j’ai vu est de loin la Gene Machine Posté le Popular Science. Il utilise une ampoule, une approche tri de Easy-cuisson au four-four à un thermocycleur standard. Un autre bricolage thermocycleur utilise des résistances dans ce instructable pour la PCR Arduino. Encore une autre utilise une approche similaire avec un élément chauffant dans le thermocycleur de tasse de café.
Une machine d’électrophorèse de gel peut être plus facile pour le biologiste bricolage à faire exécuter. Conçoit la gamme dans la complexité du relativement novice (major mettant l’accent sur le relativement) installation Posté le faire pour les plus avancés instructables pour les GellS ou le système de mini gel. Pour l’exécution d’un gel, je conseillerais à l’aide de la méthode décrit dans le post de faire ci-dessus, mais les utilisateurs plus avancés peuvent suivre l’instructable pour préparation du gel ou bien évidemment suivre le protocole sur la Vaisselle humide ouverte. Bien sûr, vous devrez soit acheter ou faire une pipette pour effectuer le transfert de liquides et de faire une courte longueur d’onde (comme ceci ou cela) de les visualiser.
Bien sûr, pour effectuer des PCR vous devrez concevoir des amorces pour amplifier votre ordre d’intérêt. Amorces sont simplement de courtes séquences d’ADN de simple brin qui sont complémentaires aux régions flanquant votre ordre d’intérêt. Ils sont nécessaires pour le séquençage de l’ADN ainsi que la plus DIY-Bio-friendly séquence spécifique PCR (SSP) qui peuvent ensuite être différenciés sur un gel. Il existe plusieurs compagnies pour amorces ordre de, en recherchant l’internet « sociétés de synthèse primer », vous pouvez être en mesure de trouver celui qui sera disponible à des particuliers ou des laboratoires de bricolage. Pour le séquençage ou SSP, il est important d’effectuer une première PCR pour amplifier et enrichir votre région cible, quelques conseils pour un ACP réussi comprennent :
- Longueurs PCR cible devraient être autour de 500bp mais rarement ils devraient dépasser 1000bp
- Prendre environ 30 secondes d’amplification par 500bp
- Garder l’apprêt avant et arrière des températures au sein de ±1 ° C de fusion si possible
- Éviter de cibler des régions avec la répétition des nucléotides (poly-tracts, c’est à dire. AAAAA... ou GCGCGCGC...)
- Évitez de mettre vos amorces dans les régions où le SNP commun
Vous pouvez voir sur la photo pour cette étape, que j’utilise Primer3 pour trouver des amorces de cibler la bêta-thalassémie SNP pour le séquençage. À l’aide de programmes tels que Primer3 pour amorces sont une bonne idée car ils vous donneront avec la thermodynamique meilleures paires d’amorces (voir ici pour les caractéristiques de l’amorce). Ensuite, vous voudrez vérifier vos amorces dans e-PCR inverse (voir la deuxième image) pour s’assurer qu’ils sont spécifiques pour seulement votre séquence cible. Pour plus d’informations sur la conception d’une bonne réaction de PCR cliquez ici.
