Étape 1: procédure :
1. les cellules de démarrage :
Récolter les cellules MDCK-G du flacon. Ici j’ai ignorer la procédure de récolte, parce que c’est une procédure assez standard dans chaque laboratoire de biologie. La cellule des semences dans les inserts de culture cellulaire de 24 puits Millicell (Millipore PIRP12L04). Pour des cellules de MDCK-G, j’ai mis 75K cellules/200uL dans chaque insert et 900ul du milieu de culture dans chaque chargeur de fond bien. Cet encart a membrane poreuse de PET 1um (autrement dit, il y a beaucoup de petits trous sur la membrane). Les cellules peuvent obtenir nutrition des deux côtés.
2. la transfection :
24 heures après l’ensemencement, les cellules de MDCK-G couvrira l’ensemble membrane et forme une couche mono.
Diluer la GFP-Josianne utilisant OPTI-MEM (Gibco 31985-070). La concentration de GFP que j’utilise est 20ug/mL. Retirer le milieu de culture de l’insert et ajouter 150uL de GFP dilué à l’intérieur de l’insert. L’iPorator peut transfecter 4 inserts de 24 puits (ou deux 6 puits insrts) à la fois. Donc je me prépare quatre inserts avec GFP.
iPorator requiert des électrodes spéciales au cours de la transfection (Primax Bioscience, E24A1108). Remplir chambre d’électrodes bas avec 1mL d’Opti-MEM. Transférer les inserts avec GFP dans chambre d’électrodes bas et mettre dans l’électrode supérieure.
Prochaine étape, placer l’électrode sertie d’inserts dans l’iPorator.
Cliquez sur « Transfection » dans l’interface utilisateur.
Le programme a un construire-dans l’ADN MDCK-G protocole de transfection, donc j’ai simplement sélectionner ce protocole et cliquez sur « Démarrer ». Il faut environ 4 minutes pour terminer la transfection.
Après la transfection, prendre l’électrode mis hors de la machine et les retransfère les inserts la plaque originale de la mangeoire. Laisser les plaquettes à température ambiante pendant environ 10 minutes avec GFP, puis remplacez la GFP par 200ul frais milieu de culture. Mettre les inserts à incubateur de culture cellulaire pendant 24 heures pour laisser l’express GFP. Pour la Josianne-GFP, vous pouvez voir quelques expression 2 heures après la transfection, mais vous devez attendre au moins pendant la nuit pour qu’il puisse pleinement exprimer.