Étape 2: Le protocole
Cet article a un bon aperçu des différentes méthodes utilisées pour DÉCELLULARISATION de tissus :
Une vue d’ensemble des tissus et des organes entiers DÉCELLULARISATION processus
Nous avons actuellement deux variantes du protocole cochon coeur : celui initialement publié par Wainwright et coll. dans leur étude de 2010et mis à jour le protocole du 2012 vidéo dans le Journal of Visualized Experiments, par le même groupe. Les deux versions commencent par congélation à -80C et décongélation puis le coeur, pour aider à briser les cellules.
Wainwright et al papier :
- Perfuse 3L 1 de Type réactif grade d’eau pendant 15 min à 1 L/min, puis 2xPBS (solution saline tamponnée au phosphate) pendant 15 min à 1 L/min
- Perfuse 0,02 % trypsine / acide éthylènediaminetétraacétique 0,05 % / 0,05 % NaN3 à 37 ° C pendant 2h à 1 L/min
- Perfuse Type 1 eau pendant 5min, puis 2xPBS pour 15min
- Perfuse 3 % Triton X-100 / acide éthylènediaminetétraacétique 0,05 % / 0,05 % NaN3 pendant 2 h à 1,3 L/min
- Perfuse Type 1 eau pendant 5min, puis 2xPBS pour 15min
- Perfuse solution acide désoxycholique à 4 % pendant 2h à 1,3 L/min
- Perfuse Type 1 eau pendant 5min, puis 2xPBS pour 15min
- Perfuse acide peracétique 0,1 % / 4 % éthanol pendant 1h à 1,7 L/min
- Perfuse deux fois avec du PBS et Type 1 d’eau trois fois, 15min chacun, à 1,7 L/min
Si vous additionnez tout ensemble, ce protocole prend environ 10 heures du début à la fin de toutes les étapes de la perfusion. La version modifiée de la vidéo de Jove traverse une grande partie les mêmes étapes, en allongeant le traitement acide désoxycholique et de trypsine à 3h et le traitement de détergent à 2,5 h, pour une durée totale de perfusion environ 13 heures ! Ils rampe également la vitesse de perfusion de 400ml/min pour la perfusion d’eau initiale, à 2,2 L/min pour le désoxycholique et les étapes suivantes.
Dans notre cas, nous avons eu seulement environ 10 heures total pour y parvenir, et nous nous sommes retrouvés par passer une bonne quantité de ce temps tester la pompe, fixation des fuites dans les connexions, dissection vers le bas le coeur etc. Donc, nous nous sommes retrouvés up ajustant les durées pour s’adapter à la durée restante.
En revanche, étant donné que nous faisions une pièce maîtresse plutôt qu’un cœur de fantôme qui pourrait être redéfinie avec succès avec des cellules souches, nous savions que nous pouvions facilement tricher sur certains des ingrédients. En particulier, nous avons utilisé l’eau du robinet ordinaire au lieu de gallons et de gallons d’eau de qualité du réactif de « Type 1 » cher. De même, nous avons utilisé le sel de cuisine ordinaire dans l’eau du robinet au lieu d’une solution saline tamponnée au phosphate. Nous avons utilisé une autre marque (percarbonate de sodium) au lieu de l’acide peracétique et 151-preuve, Everclear , plutôt que de l’éthanol réactif pour l’étape de désinfection finale. Nous voulions également utiliser SDS plutôt que Triton X-100 comme la lessive, étant donné que le SDS a tendance à blanchir les tissus meilleure (au détriment de l’être somewha plus sévère sur la matrice extracellulaire). Nous n’avions pas assez SDS, donc nous nous sommes retrouvés par aller avec SDD 2 % / 1 % X-100 Triton. Nous avons également laissé de côté l' azoture de sodium (NaN3), qui est là pour inhiber la croissance bactérienne, mais est également très toxique - quelque chose nous aurait plutôt pas salir avec dans un cadre de bricolage.
Oh et nous n’avions pas accès à une pompe péristaltique à volume élevé, mais nous avons une pompe de Recirculation de tampon de Bio-Rad (voir http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/M1702929C.pdf) qui peut théoriquement faire jusqu'à 1. 5 L/min. Pas conçu pour fournir le genre de pressions, que nous avons besoin, mais meh - nous allons juste voir ce qui se passe...
Voici donc ce que nous avons retrouvé avec en fin de compte :
- Perfuse 3L eau du robinet pendant 15min, puis élevé salin (sel de cuisine 50g en 3L eau du robinet) pendant 15min
- Perfuse 0,02 % trypsine / acide éthylènediaminetétraacétique 0,05 % à 37 ° C pendant 1,5 h
- Perfuse l’eau du robinet pendant 10min, puis grande saline pendant 10min
- Perfuse SDS 2 % / 1 % Triton X-100 pendant 50 min
- Perfuse l’eau du robinet pendant 5min, puis grande saline pendant 5min
- Perfuse 2,5 % d’acide désoxycholique (25g dans 1L) pendant 20min
- Perfuse l’eau du robinet pendant 5min, puis grande saline pendant 5min
- Perfuse 0,5 % OxyClean / éthanol de 4 % pendant 1h à 1,7 L/min
- Perfuse saline (25g dans 3L), puis l’eau du robinet pendant 5min
- Laissez drain, puis les trucs dans Ikea bocal avec 151 Everclear preuve !