Étape 1: Culture de cellules embryonnaires
-Avant de commencer quoi que ce soit, gants et stériliser.
-Stérilisation est extrêmement important dans le processus d’ingénierie tissulaire. Contamination due aux produits chimiques et bactéries peut détruire des semaines de travail et perdre tout l’argent mis dans le projet. L’éthanol est votre nouveau meilleur ami ; des gens pourraient penser que vous avez devenu un alcoolique quand ils sentent votre nouvel ami sur vous tout le temps, mais c’est la meilleure chose jamais. Aussi ne soyez pas trop préoccupé quand vous renversez à peu près tout du laboratoire ; elle s’évapore super rapidement.
-Une fois stérile ouvrir l’incubateur en que vous avez été stocker votre ostéoblastes.
-Nous voulons vérifier maintenant pour confluence. Confluence parle de tissus pour la densité de population cellulaire.
-Vous voulez avoir > 85 % (environ) confluence avant passage des cellules. Ce qui signifie que 85 % de la champ de vision, que vous voyez à travers votre microscope a cellules. C’est important de rester sur le dessus de parce que les cellules confluentes ne continuera pas à reproduire. Il est également bon pour la croissance de cellules autant que possible parce qu’ils sont une ressource précieuse qui vous pourriez avoir besoin.
-Si non confluentes, vous devez donner à vos cellules plus de temps à se développer. Donc stériliser le ballon, apportez-le au banc hotte/nettoyer et aspirer les médias hors de lui tout en étant conscient de pas raclent le fond de la fiole où vivent les cellules. Jetez votre pipette. Avec une nouvelle pipette, remplissez simplement le fond du flacon avec les nouveaux médias.
-Si elle est confluente, vous aurez besoin pour vos cellules de passage.
- Stériliser le ballon et l’amener à la hotte.
- Aspirer les médias sans gratter le fond du flacon. Jeter la pipette.
- Laver les cellules dans du PBS en pipettant également, dans le ballon assez PBS pour couvrir le fond. Basculer doucement le ballon en arrière.
- Aspirer les PBS et jeter la pipette.
- Pipetter suffisamment la trypsine dans le ballon pour recouvrir le fond. Inclinez-le en arrière.
- Stériliser le ballon et il incuber pendant 2 min.
- Aspirer les cellules et la trypsine et insérez-les dans un tube à centrifuger.
- Centrifuger pendant 5 min à 1300 tr/min (revoir la technique de centrifugation et n’oubliez pas le contrepoids).
- Aspirer la trypsine tout en étant conscient de ne pas prendre le culot cellulaire. Jeter la pipette.
- Insérez un volume connu de médias dans le tube.
- Aspirer les médias et pellet de suspendre les cellules.
- Effectuer un nombre d’éléments pour comprendre votre densité cellulaire par les médias de volume.
- Distribuer vos cellules en suspension dans des fioles de nouveau.
- Couvrir le fond des fioles avec les médias. Marquer le ballon avec la date et votre nom. Stériliser et incuber.
Le manuel de culture cellulaire, nous avons utilisé en classe est jointe. Il est très complet et une ressource impressionnante.
